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10彩票高书山研究组建立适用于多核工业菌株的基因编辑系统

作者: 发布时间:2020.06.15 文章来源:

      日前,高书山课题组构建了一种适用于多核工业菌的基因编辑系统,可实现大片段DNA无痕删除,为我国微生物工业发酵菌株的遗传改造提供了一种新型高效基因编辑工具,相关成果“A dual-plasmid CRISPR/Cas system for mycotoxin elimination in polykaryotic industrial fungi”已发表在合成生物学权威期刊ACS Synthetic Biology上。通过该方法,高书山课题组在红曲红色素多核生产菌Monascus purpureus中实现了内毒素桔青霉素生物合成基因簇(15 kb)的无痕敲除。新菌株经过科隆公司的小罐发酵、中罐发酵以及大罐发酵等层层严格验证,发酵产品品质显著高于目前市场上同类产品,已经应用于千吨级红曲红色素的工业生产,为企业取得了显著的经济效益。

 

  1. 双质粒Cas系统的工作流程示意图 

 

  红曲红色素是中华民族宝贵的科学遗产,被广泛地应用于食品业的着色,也可以作为保健品缓解心脑血管和高血脂等相关疾病。但是红曲红色素工业菌株可同时生产具有肾毒性和致癌性的桔青霉素;我国和欧盟、日本等均对产品中桔青霉素的含量做出了限制性规定,我国标准为4 mg/kg。由于缺乏较好的遗传操作工具,目前相关生产企业通过改变发酵工艺、随机突变等手段,满足桔青霉素含量标准,造成企业生产能力的巨大浪费;另一方面多数企业的红曲红产品因桔青霉素含量超标而出口受阻,降低了我国在该领域的国际竞争力。因此选育低产或不产生桔霉素的新红曲霉工业发酵菌株迫在眉睫。 

 

  相较于放线菌等原核生物,多核菌基因组更为庞大和复杂、在单一细胞内存在不同的细胞核,普通基因敲除方法难以实现目标基因的彻底敲除,因此目前尚未有高效的基因编辑方法应用于工业多核菌株。针对这一困境,研究人员构建了一种新的双质粒基因编辑系统:含密码子优化后的Cas9质粒和含有目的基因上下游同源臂的同源重组质粒。为了保证敲除效率,在Cas9质粒上引入了抗性基因和多核菌自主复制子。该方法成功实现桔青霉素生物合成基因簇(>15 kb)高效无痕删除。LC-MS检测结果表明,该方法得到的突变株经过10轮培养,仍未检测到桔青霉素,且红曲红色素产量比改造前提高了约5% 

 

  10彩票助理研究员刘魏魏和博士后安春艳为论文共同第一作者,高书山研究员和美国莱斯大学化学与分子生物功能系助理教授高雪为共同通讯作者,向华研究员和华中农业大学陈福生教授对本文提供了宝贵的修改意见。本项目得到了国家重点研发计划、中国科学院战略性先导科技专项、国家自然科学基金以及中国科学院交叉创新平台等项目经费的大力支持。高书山课题组感谢陈义华研究员、范克强研究员、王为善研究员以及潘国辉研究员给予宝贵的实验空间。 

 

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